Что такое сканирующий микроскоп. Сканирующий зондовый микроскоп

Класс микроскопов для получения изображения поверхности и её локальных характеристик. Процесс построения изображения основан на сканировании поверхности зондом. В общем случае позволяет получить 3-х мерное изображение поверхности (топографию) с высоким разрешением.

Сканирующий зондовый микроскоп в современном виде был изобретён Гердом Карлом Биннигом и Генрихом Рорером в 1981 году. За это изобретение в 1986 были награждены Нобелевской премией по физике.

Отличительной особенностью всех микроскопов является микроскопический зонд, который контактирует с исследуемой поверхностью, и при сканировании перемещается по некоторому участку поверхности заданного размера.

Контакт зонда и образца подразумевает взаимодействие. Природа взаимодействия определяет принадлежность прибора к типу зондовых микроскопов. Информация о поверхности извлекается с помощью системы обратной связи или детектирования взаимодействия зонда и образца.

Система регистрирует значение функции, зависящей от расстояния зонд - образца.

Типы сканирующих зондовых микроскопов.

Сканирующий атомно-силовой микроскоп

Сканирующий туннельный микроскоп

Ближнепольный оптический микроскоп

Сканирующий туннельный микроскоп

Один из вариантов сканирующего микроскопа, предназначенный для изменения рельефа проводящих систем с высоким пространственным разрешением.

Принцип работы основан на прохождение электроном потенциального барьера в результате разрыва электрической цепи – небольшой промежуток между зондирующим микроскопом и поверхностью образца. Острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем. При подаче на иглу небольшого потенциала возникает туннельный ток, величина которого экспоненциально зависит от расстояния образец - игла. При расстоянии 1ангстремма образец – игла значение силы тока колеблется от 1 до 100 пА.

При сканировании образца игла движется вдоль её поверхности, туннельный ток поддерживается за счёт действия обратной связи. Показания системы меняется за счёт топографии поверхности. Изменение поверхности фиксируется и на этом основании строится карта высот.

Другой метод предполагает движение иглы на фиксированной высоте над поверхностью образца. В этом случае изменяется величина туннельного тока и на основе этих изменений идёт построение топографии поверхности.

Рисунок 1. Схема работы сканирующего туннельного микроскопа.

Сканирующий туннельный микроскоп включает в себя:

Зонд (игла)

Систему перемещения зона по координатам

Регистрирующую систему

Регистрирующая система фиксирует значение функции, зависящая от величины тока между иглой и образцом, либо перемещения по оси Z. Регистрируемое значение обрабатывается системой обратной связи, управляя положением образца или зонда по оси координат. В качестве обратной связи используется пид - регулятор (пропорционально – интегрально – дифференцирующей регулятор).

Ограничение:

Условие проводимости образца (поверхностное сопротивление должно быть не больше 20 МОм/см²).

Глубина канавки должна быть меньше её ширины, иначе будет наблюдаться туннелирование с боковых поверхностей.

7.Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов

7. Применение сканирующего зондового микроскопа для исследования биологических объектов 1

7.1. Цели работы 2

7.2. Информация для преподавателя 3

7.4. Методические указания 31

7.5. Техника безопасности 32

7.6. Задание 32

7.7. Контрольные вопросы 32

7.8. Литература 32

Лабораторная работа была разработана Нижегородским Государственным Университетом им. Н.И. Лобачевского

7.1.Цели работы

Исследование морфологических параметров биологических структур является важной задачей для биологов, поскольку размеры и форма некоторых структур во многом определяют их физиологические свойства. Сопоставляя морфологические данные с функциональными характеристиками можно получить полноценную информацию об участии живых клеток в поддержании физиологического баланса организма человека или животного.

Раньше биологи и медики имели возможность изучать свои препараты только на оптическом и электронном микроскопах. Эти исследования давали некую картину морфологии клеток, зафиксированных, окрашенных и с тонкими металлическими покрытиями, полученными путем напыления. Исследовать морфологию живых объектов, ее изменения под воздействием различных факторов не представлялось возможным, но являлось весьма заманчивым.

Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) открыла новые возможности в исследовании клеток, бактерий, биологических молекул, ДНК в условиях максимально приближенных к нативным. СЗМ позволяет исследовать биологические объекты без специальных фиксаторов и красителей, на воздухе, или даже в жидкой среде.

В настоящее время СЗМ используется в большом многообразии дисциплин, как в фундаментальных научных исследованиях, так и в прикладных высокотехнологичных разработках. Многие научно-исследовательские институты страны оснащаются аппаратурой зондовой микроскопии. В связи с этим постоянно растет спрос на высококлассных специалистов. Для его удовлетворения фирмой НТ-МДТ (г. Зеленоград, Россия) разработана специализированная учебно-научная лаборатория сканирующей зондовой микроскопии NanoEducator .

СЗМ NanoEducator специально разработан для проведения студентами лабораторных работ. Этот прибор ориентирован на студенческую аудиторию: он полностью управляется с помощью компьютера, имеет простой и наглядный интерфейс, анимационную поддержку, предполагает поэтапное освоение методик, отсутствие сложных настроек и недорогие расходные материалы.

В данной лабораторной работе Вы узнаете о сканирующей зондовой микроскопии, познакомитесь с ее основами, изучите конструкцию и принципы работы учебного СЗМ NanoEducator , научитесь готовить биологические препараты для исследований, получите свое первое СЗМ изображение комплекса кисломолочных бактерий и научитесь основам обработки и представления результатов измерений.

7.2.Информация для преподавателя 1

Лабораторная работа выполняется в несколько этапов:

1. Подготовка образца выполняется каждым студентом индивидуально.

2. Получение первого изображения выполняется на одном приборе под контролем преподавателя, далее каждый студент исследует свой образец самостоятельно.

3. Обработка экспериментальных данных каждым студентом производится индивидуально.

Образец для исследования: кисломолочные бактерии на покровном стекле.

До начала работы необходимо подобрать зонд с наиболее характерной амплитудно-частотной характеристикой (одиночный симметричный максимум), получить изображение поверхности исследуемого образца.

Отчет по лабораторной работе должен включать:

1. теоретическую часть (ответы на контрольные вопросы).

2. результаты экспериментальной части (описание проведенных исследований, полученные результаты и сделанные выводы).

1. Методы исследований морфологии биологических объектов.

2. Сканирующий зондовый микроскоп:

конструкция СЗМ;

разновидности СЗМ: СТМ, АСМ;

формат СЗМ данных, визуализация СЗМ данных.

3. Подготовка образцов для СЗМ исследований:

морфология и структура бактериальных клеток;

приготовление препаратов для изучения морфологии с применением СЗМ.

4. Знакомство с конструкцией и программой управления СЗМ NаnoEducator.

5. Получение СЗМ изображения.

6. Обработка и анализ полученных изображений. Количественная характеризация СЗМ изображений.

Методы исследования морфологии биологических объектов

Характерный диаметр клеток составляет 10  20 мкм, бактерий от 0.5 до 35 мкм, эти величины в 5 раз мельче мельчайшей частицы, видимой невооруженным глазом. Поэтому первое изучение клеток стало возможным только после появления оптических микроскопов. В конце XVII в. Антонио ван Левенгук изготовил первый оптический микроскоп, до этого люди и не подозревали о существовании болезнетворных микробов и бактерий [Лит. 7 -1].

Оптическая микроскопия

Трудности изучения клеток связаны с тем, что они бесцветны и прозрачны, поэтому открытие их основных структур состоялось только после введения в практику красителей. Красители обеспечили достаточный контраст изображения. С помощью оптического микроскопа можно различать объекты, отстоящие друг от друга на 0.2 мкм, т.е. самыми маленькими объектами, которые еще можно различать в оптическом микроскопе являются бактерии и митохондрии. Изображения более мелких элементов клеток искажаются эффектами, вызванными волновой природой света.

Для приготовления долго сохраняющихся препаратов клетки обрабатывают фиксирующим агентом с тем, чтобы иммобилизовать и сохранить их. Кроме того, фиксация повышает доступность клеток красителям, т.к. макромолекулы клеток скрепляются поперечными сшивками, что стабилизирует и закрепляет их в определенном положении. Чаще всего в качестве фиксаторов выступают альдегиды и спирты (например, глутаральдегид или формальдегид формируют ковалентные связи со свободными аминогруппами белков и сшивают соседние молекулы). После фиксации ткани обычно нарезают микротомом на очень тонкие срезы (толщиной от 1 до 10 мкм), которые затем помещают на предметное стекло. При таком способе подготовки можно повредить структуру клеток или макромолекул, поэтому предпочтительным методом является быстрое замораживание. Замороженную ткань режут микротомом, установленным в холодной камере. После приготовления срезов клетки окрашивают. В основном для этой цели используют органические красители (малахитовую зелень, судан черный и т.д.). Каждый из них характеризуется определенным сродством к клеточным компонентам, например, гематоксилин обладает сродством к отрицательно заряженным молекулам, поэтому позволяет выявить в клетках ДНК. Если та или иная молекула представлена в клетке в незначительном количестве, то удобнее всего использовать флуоресцентную микроскопию.

Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцирующие красители поглощают свет одной длины волны и излучают свет другой, большей длины волны. Если такое вещество облучить светом, длина волны которого совпадает с длиной волны света, поглощаемого красителем, и затем для анализа использовать фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей свету, излучаемому красителем, флуоресцирующую молекулу можно выявить по свечению на темном поле. Высокая интенсивность излучаемого света является характерной особенностью таких молекул. Применение флуоресцирующих красителей для окраски клеток предполагает использование специального флуоресцентного микроскопа.Такой микроскоп похож на обычный оптический, но свет от мощного осветителя проходит через два набора фильтров - один для задержания части излучения осветителя перед образцом и другой для фильтрации света, полученного от образца. Первый фильтр выбран таким образом, что он пропускает лишь свет длины волны, возбуждающей определенный флуоресцирующий краситель; в то же время второй фильтр блокирует этот падающий свет и пропускает свет длины волны, излучаемой красителем при его флуоресценции.

Флуоресцентная микроскопия часто используется для выявления специфических белков или других молекул, которые становятся флуоресцирующими после ковалентного связывания с флуоресцирующими красителями. Для этой цели обычно используют два красителя - флуоресцеин, который дает интенсивную желто-зеленую флуоресценцию после возбуждения светло-голубым светом, и родамин, обусловливающий темно-красную флуоресценцию после возбуждения желто-зеленым светом. Применяя для окраски и флюоресцин и родамин можно получать распределение различных молекул.

Темнопольная микроскопия

Простейший способ разглядеть детали клеточной структуры – наблюдать свет, рассеивающийся различными компонентами клетки. В темнопольном микроскопелучи от осветителя направляются сбоку и при этом в объектив микроскопа попадают только рассеянные лучи. Соответственно, клетка выглядит как освещенный объект на темном поле. Одним из основных преимуществ темнопольной микроскопии является возможность наблюдать движение клеток в процессе деления и миграции. Клеточные движения, как правило, совершаются очень медленно и их сложно наблюдать в реальном времени. В этом случае используют покадровую (цейтраферную) микрокиносъемку или видеозапись. Последовательные кадры при этом разделены во времени, но при воспроизведении записи с нормальной скоростью картина реальных событий ускоряется.

В последние годы видеокамеры и соответствующие технологии обработки изображения значительно увеличили возможности оптической микроскопии. Благодаря их применению удалось преодолеть трудности, обусловленные особенностями физиологии человека. Они состоят в том, что:

1. Глаз в обычных условиях не регистрирует очень слабый свет.

2. Глаз не способен фиксировать небольшие отличия в интенсивности света на ярком фоне.

Первая из этих проблем была преодолена после присоединения к микроскопу сверхвысокочувствительных видеокамер. Это позволило наблюдать клетки в течение длительного времени при низкой освещенности, исключая длительное воздействие яркого света. Системы обработки изображения особенно важны для изучения в живых клетках флуоресцирующих молекул. Поскольку изображение создается видеокамерой в форме электронных сигналов, его можно соответствующим образом преобразовать в числовые сигналы, направить в компьютер и затем подвергнуть дополнительной обработке для извлечения скрытой информации.

Высокий контраст, достижимый с помощью компьютерной интерференционной микроскопии, позволяет наблюдать даже очень мелкие объекты, как, например, отдельные микротрубочки, диаметр которых менее одной десятой длины волны света (0.025 мкм). Отдельные микротрубочки можно увидеть и с помощью флуоресцентной микроскопии. Однако в обоих случаях неизбежны эффекты дифракции, сильно изменяющие изображение. Диаметр микротрубочек при этом завышается (0.2 мкм), что не позволяет отличать отдельные микротрубочки от пучка из нескольких микротрубочек. Для решения этой задачи необходим электронный микроскоп, предел разрешения которого сдвинут далеко за пределы длины волны видимого света.

Электронная микроскопия

Взаимосвязь длины волны и предела разрешения сохраняется и для электронов. Однако для электронного микроскопа предел разрешения существенно ниже дифракционного предела. Длина волны электрона уменьшается с увеличением его скорости. В электронном микроскопе с напряжением 100000 В длина волны электрона равна 0.004 нм. Согласно теории, разрешение такого микроскопа в пределе составляет 0.002 нм. Однако в реальности вследствие малой величины числовых апертур электронных линз разрешение современных электронных микроскопов в лучшем случае составляет 0,1 нм. Трудности приготовления образца, его повреждение излучением существенно снижают нормальное разрешение, которое для биологических объектов составляет 2 нм (примерно в 100 раз выше, чем у светового микроскопа).

Источником электронов в просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) является нить катода, расположенная в вершине цилиндрической колонны высотой около двух метров. Чтобы избежать рассеивания электронов при столкновениях с молекулами воздуха, в колонне создается вакуум. Электроны, излучаемые катодной нитью, ускоряются ближайшим анодом и проникают через крошечное отверстие, формируя электронный луч, проходящий в нижнюю часть колонны. Вдоль колонны на некотором расстоянии расположены кольцевые магниты, фокусирующие электронный луч, подобно стеклянным линзам, фокусирующим луч света в оптическом микроскопе. Образец через воздушный шлюз помещают внутрь колонны, на пути электронного пучка. Часть электронов в момент прохождения через образец рассеивается в соответствии с плотностью вещества в данном участке, остаток электронов фокусируется и формирует изображение (подобно формированию изображения в оптическом микроскопе) на фотопластинке или на фосфоресцирующем экране.

Одним из самых больших недостатков электронной микроскопии является то, что биологические образцы необходимо подвергнуть специальной обработке. Во-первых, их фиксируют сначала глутаровым альдегидом, а затем осмиевой кислотой, связывающей и стабилизирующей двойной слой липидов и белков. Во-вторых, электроны обладают низкой проникающей способностью, поэтому приходится делать сверхтонкие срезы, а для этого образцы обезвоживают и пропитывают смолами. В-третьих, для усиления контраста образцы обрабатывают солями тяжелых металлов, такими как осмий, уран и свинец.

Для того, чтобы получить трехмерное изображение поверхности используется сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) , где используются электроны, рассеиваемые или излучаемые поверхностью образца. Образец в данном случае фиксируют, высушивают и покрывают тонкой пленкой тяжелого металла, а затем сканируют узким пучком электронов. При этом оценивается количество электронов, рассеиваемых при облучении поверхности. Полученное значение используют для контроля интенсивности второго луча, движущегося синхронно первому и формирующему изображение на экране монитора. Разрешение метода около 10 нм и он не применим для изучения внутриклеточных органелл. Толщина образцов, изучаемых этим методом, определяется проникающей способностью электронов или их энергией.

Основными и существенными недостатками всех этих методов является длительность, сложность и высокая стоимость приготовления образца.

Сканирующая зондовая микроскопия

В сканирующем зондовом микроскопе (СЗМ) вместо электронного луча или оптического излучения используется острийный зонд, игла, сканирующая поверхность образца. Образно выражаясь, можно сказать, что если в оптическом или электронном микроскопах образец осматривается, то в СЗМ – ощупывается. В результате можно получать трехмерные изображения объектов в разных средах: вакууме, воздухе, жидкости.

Специальные конструкции СЗМ, адаптированные для биологических исследований, позволяют одновременно с оптическим наблюдением сканировать как живые клетки в разных жидких средах, так и фиксированные препараты на воздухе.

Сканирующий зондовый микроскоп

В названии сканирующего зондового микроскопа отражен принцип его действия – сканирование поверхности образца, при котором осуществляется поточечное считывание степени взаимодействия зонда с поверхностью. Размер области сканирования и количество точек в ней N X ·N Y можно задавать. Чем больше задается точек, тем с большим разрешением получается изображение поверхности. Расстояние между точками считывания сигнала называется шагом сканирования. Шаг сканирования должен быть меньше изучаемых деталей поверхности. Перемещение зонда в процессе сканирования (см. Рис. 7 -1) осуществляется линейно в прямом и в обратном направлении (в направлении быстрого сканирования), переход на следующую линию осуществляется в перпендикулярном направлении (в направлении медленного сканирования).

Рис. 7 1. Схематическое изображение процесса сканирования
(считывание сигнала осуществляется на прямом ходе сканера)

В зависимости от характера считываемого сигнала, сканирующие микроскопы имеют различные названия и назначения:

атомно-силовой микроскоп (АСМ), считываются силы межатомного взаимодействия между атомами зонда и атомами образца;

туннельный микроскоп (СТМ), считывается туннельный ток, протекающий между проводящим образцом и проводящим зондом;

магнитно-силовой микроскоп (МФМ), считываются силы взаимодействия между зондом, покрытым магнитным материалом, и обнаруживающим магнитные свойства образцом;

электростатический силовой микроскоп (ЭСМ) позволяет получать картину распределения электрического потенциала на поверхности образца. Используются зонды, кончик которых покрыт тонкой проводящей пленкой (золото или платина).

Конструкция СЗМ

СЗМ состоит из следующих основных компонентов (Рис 7 -2): зонда, пьезоэлектрических приводов для перемещения зонда по X, Y, Z над поверхностью исследуемого образца, цепи обратной связи и компьютера для управления процессом сканирования и получением изображения.

Рис 7 2. Схема сканирующего зондового микроскопа

Зондовый датчик – компонент силового зондового микроскопа, осуществляющий сканирование препарата. Зондовый датчик содержит кантилевер (пружинную консоль) прямоугольного (I- образного) или треугольного (V-образного) типов (Рис. 7 -3), на конце которого размещен острийный зонд (Рис. 7 -3), имеющий обычно конусную или пирамидальную форму. Другим концом кантилевер стыкуется с подложкой (с так назывемым чипом). Зондовые датчики изготавливаются из кремния или нитрида кремния. Основной характеристикой кантилевера является силовая константа (константа жесткости), она варьируется от 0.01 N/m до 1020 N/m. Для исследований биологических объектов используются “мягкие” зонды с жесткостью 0.01  0.06 N/m.

Рис. 7 3. Изображения пирамидальных АСМ зондовых датчиков
полученное с помощью электронного микроскопа:
а – I- образный тип, б – V- образный тип, с – пирамидка на кончике кантилевера

Пьезоэлектрические приводы или сканеры - для контролируемого перемещения зонда над образцом или самого образца относительно зонда на сверхмалых расстояниях. В пьезоэлектрических приводах используются пьезокерамические материалы, которые изменяют свои размеры при приложении к ним электрического напряжения. Процесс изменения геометрических параметров под действием электрического поля называется обратным пьезоэффектом. Наиболее распространенный пьезоматериал - цирконат-титанат свинца.

Сканер - конструкция из пьезокерамики, обеспечивающая перемещение по трем координатам: x, y (в латеральной плоскости образца) и z (по вертикали). Существует несколько типов сканеров, наиболее распространенными из которых являются триподные и трубчатые (Рис. 7 -4).

Рис. 7 4. Конструкции сканеров: а) – триподный, б) – трубчатый

В триподном сканере перемещения по трем координатам обеспечивают образующие ортогональную структуру три независимых пьезокерамических стержня.

В трубчатом сканере полая пьезоэлектрическая трубка изгибается в плоскостях XZ и ZY и удлиняется или сжимается по оси Z при подаче соответствующих напряжений на электроды, управляющие перемещениями трубки. Электроды для управления движением в плоскости XY расположены на наружной поверхности трубки, для управления перемещением по Z на X и Y электроды подаются равные напряжения.

Цепь обратной связи – совокупность элементов СЗМ, с помощью которой при сканировании зонд удерживается на фиксированном расстоянии от поверхности образца (Рис. 7 -5). В процессе сканирования зонд может находиться на участках поверхности образца с разным рельефом, при этом будет изменяться расстояние Z зонд-образец, соответственно будет изменяться и величина взаимодействия зонд-образец.

Рис. 7 5. Схема обратной связи сканирующего зондового микроскопа

При приближении зонда к поверхности возрастают силы взаимодействия зонд-образец, возрастает и сигнал регистрирующего устройства V (t ), который выражается в единицах напряжения. Компаратор сравнивает сигнал V (t ) с опорным напряжением V опорное и вырабатывает корректирующий сигнал V корр . Сигнал коррекции V корр подается на сканер, и зонд отводится от образца. Опорное напряжение – напряжение, соответствующее сигналу регистрирующего устройства, когда зонд оказывается на заданном расстоянии от образца. Поддерживая в процессе сканирования это заданное расстояние зонд-образец, система обратной связи поддерживает заданную силу взаимодействия зонд-образец.

Рис. 7 6. Траектория относительного движения зонда в процессе поддержания системой обратной связи постоянной силы взаимодействия зонд-образец

На Рис. 7 -6 показана траектория движения зонда относительно образца при сохранении постоянной силы взаимодействия зонд-образец. Если зонд оказывается над ямкой, на сканер подается напряжение, при котором сканер удлиняется, опуская зонд.

Быстрота отклика цепи обратной связи на изменение расстояния зонд-образец (взаимодействия зонд-образец) определяется константой цепи обратной связи K . Значения K зависят от особенностей конструкции конкретного СЗМ (конструкции и характеристик сканера, электроники), режима работы СЗМ (размера области сканирования, скорости сканирования и т.п.), а также особенностей исследуемой поверхности (масштаба особенностей рельефа, твердости материала и пр.).

Разновидности СЗМ

Сканирующий туннельный микроскоп

В СТМ регистрирующим устройством (Рис. 7 -7) измеряется туннельный ток, протекающий между металлическим зондом, который изменяется в зависимости от потенциала на поверхности образца и от рельефа его поверхности. Зонд представляет собой остро заточенную иглу, радиус закругления острия которой может достигать нескольких нанометров. В качестве материала для зонда обычно используются металлы с высокой твердостью и химической стойкостью: вольфрам или платина.

Рис. 7 7. Схема туннельного зондового датчика

Между проводящим зондом и проводящим образцом прикладывается напряжение. Когда кончик зонда оказывается на расстоянии около 10А от образца, электроны из образца начинают туннелировать через промежуток в зонд или наоборот, в зависимости от знака напряжения (Рис. 7 -8).

Рис. 7 8. Схематическое изображение взаимодействия кончика зонда с образцом

Возникающий при этом туннельный ток измеряется регистрирующим устройством. Его величина I Т пропорциональна приложенному к туннельному контакту напряжению V и экспоненциально зависит от расстояния от иглы до образца d .

Таким образом, малым изменениям расстояния от кончика зонда до образца d отвечают экспоненциально большие изменения туннельного тока I Т (предполагается, что напряжение V поддерживается постоянным). В силу этого чувствительность туннельного зондового датчика достаточна, чтобы зарегистрировать изменения высот менее 0,1 нм, и, следовательно, получить изображение атомов на поверхности твердого тела.

Атомно-силовой микроскоп

Наиболее распространенным зондовым датчиком атомно-силового взаимодействия является пружинный кантилевер (от англ. cantilever - консоль) с расположенным на его конце зондом. Величина изгиба кантилевера, возникающего вследствие силового взаимодействия между образцом и зондом (Рис 7 -9), измеряется с помощью оптической схемы регистрации.

Принцип действия силового датчика основан на использовании атомных сил, действующих между атомами зонда и атомами образца. При изменении силы зонд-образец меняется величина изгиба кантилевера, и такое изменение измеряется оптической системы регистрации. Таким образом, атомно-силовой датчик представляет собой острийный зонд с высокой чувствительностью, позволяющей регистрировать силы взаимодействия между отдельным атомами.

При малых изгибах соотношение между силой зонд-образец F и отклонением кончика кантилевера x определяется законом Гука:

где k – силовая константа (константа жесткости) кантилевера.

Например, если используется кантилевер с константой k порядка 1 н/м, то под действием силы взаимодействия зонд-образец порядка 0.1 наноньютона величина отклонения кантилевера составит примерно 0.1 нм.

Для измерения столь малых перемещений обычно используется оптический датчик смещений (Рис 7 -9), состоящий из полупроводникового лазера и четырехсекционного фотодиода. При изгибе кантилевера отраженный от него луч лазера смещается относительно центра фотодетектора. Таким образом, изгиб кантилевера может быть определен по относительному изменению освещенности верхней (T)и нижней (B) половинок фотодетектора.

Рис 7 9. Схема силового датчика

Зависимость сил взаимодействия зонд-образец от расстояния зонд-образец

При приближении зонда к образцу он сначала притягивается к поверхности благодаря наличию притягивающих сил (силы Ван-дер-Ваальса). При дальнейшем приближении зонда к образцу электронные оболочки атомов на конце зонда и атомов на поверхности образца начинают перекрываться, что приводит к появлению отталкивающей силы. При дальнейшем уменьшении расстояния отталкивающая сила становится доминирующей.

В общем виде зависимость силы межатомного взаимодействия F от расстояния между атомами R имеет вид:

.

Константы a и b и показатели степени m и n зависят от сорта атомов и типа химических связей. Для сил Ван-дер-Ваальса m =7 и n=3 . Качественно зависимость F(R) показана на Рис. 7 -10.

Рис. 7 10.Зависимость силы взаимодействия между атомами от расстояния

Формат СЗМ - данных, визуализация СЗМ – данных

Данные о морфологии поверхности, полученные при исследовании на оптическом микроскопе, представляются в виде увеличенного изображения участка поверхности. Информация, получаемая с помощью СЗМ, записывается в виде двухмерного массива целых чисел A ij . Каждому значению ij соответствует определенная точка поверхности в пределах поля сканирования. Графическое отображение этого массива чисел называется СЗМ сканированным изображением.

Сканированные изображения могут быть как двумерными (2D), так и трехмерными (3D). При 2D визуализации каждой точке поверхности Z=f (x,y ) ставится в соответствие определенный цветовой тон в соответствии с высотой точки поверхности (Рис. 7 -11 а). При 3D визуализации изображение поверхности Z=f (x,y ) строится в аксонометрической перспективе с помощью определенным образом рассчитанных пикселей или линий рельефа. Наиболее эффективным способом раскраски 3D изображений является моделирование условий подсветки поверхности точечным источником, расположенным в некоторой точке пространства над поверхностью (Рис. 7 -11 б). При этом удается подчеркнуть отдельные малые особенности рельефа.

Рис. 7 11. Лимфоциты крови человека:
а) 2D-изображение, б) 3D изображение с боковой подсветкой

Подготовка образцов для СЗМ исследования

Морфология и структура бактериальных клеток

Бактерии – одноклеточные микроорганизмы, имеющие разнообразную форму и сложную структуру, определяющую многообразие их функциональной деятельности. Для бактерий характерны четыре основные формы: сферическая (шаровидная), цилиндрическая (палочковидная), извитая и нитевидная [Лит. 7 -2].

Кокки (бактерии шаровидной формы) – в зависимости от плоскости деления и расположения отдельных особей подразделяются на микрококки (отдельно лежащие кокки), диплококки (парные кокки), стрептококки (цепочки кокков), стафилококки (имеющие вид виноградных гроздьев), тетракокки (образования из четырех кокков) и сарцины (пакеты из 8 или 16 кокков).

Палочковидные – бактерии располагаются в виде одиночных клеток, дипло- или стрептобактерий.

Извитые – вибрионы, спириллы и спирохеты. Вибрионы имеют вид слегка изогнутых палочек, спириллы – извитую форму с несколькими спиральными завитками.

Размеры бактерий колеблются от 0.1 до 10 мкм. В состав бактериальной клетки входят капсула, клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана и цитоплазма. В цитоплазме находятся нуклеотид, рибосомы и включения. Некоторые бактерии снабжены жгутиками и ворсинками. Ряд бактерий образуют споры. Превышая исходный поперечный размер клетки, споры придают ей веретенообразную форму.

Для изучения морфологии бактерий на оптическом микроскопе из них готовят нативные (прижизненные) препараты или фиксированные мазки, окрашенные анилиновым красителем. Существуют специальные методы окраски для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеотида и разных цитоплазматических включений.

Для СЗМ исследования морфологии бактериальных клеток не требуется окрашивания препарата. СЗМ позволяет с высокой степенью разрешения определить форму и размер бактерий. При тщательном приготовлении препарата и использовании зонда с малым радиусом закругления возможно выявление жгутиков. В то же время из-за большой жесткости клеточной стенки бактерий нельзя «прощупать» внутриклеточные структуры, как это можно сделать на некоторых животных клетках.

Приготовление препаратов для СЗМ изучения морфологии

Для первого опыта работы с СЗМ рекомендуется выбрать биологический препарат, который не требует сложной подготовки. Вполне подойдут легкодоступные и непатогенные кисломолочные бактерии из рассола квашеной капусты или кисломолочных продуктов.

Для СЗМ исследования на воздухе требуется прочно зафиксировать исследуемый объект на поверхности подложки, например, на покровном стекле. Кроме того, плотность бактерий в суспензии должна быть такова, чтобы клетки при осаждении на подложку не слипались, и расстояние между ними было не слишком велико, чтобы при сканировании можно было в один кадр взять несколько объектов. Эти условия выполняются, если правильно выбрать режим приготовления образца. Если нанести каплю раствора, содержащего бактерии, на подложку, то будет происходить их постепенное осаждение и адгезия. Основными параметрами при этом следует считать концентрацию клеток в растворе и время осаждения. Концентрацию бактерий в суспензии определяют по оптическому стандарту мутности.

В нашем случае роль будет играть лишь один параметр – время инкубации. Чем дольше выдерживать каплю на стекле, тем больше окажется плотность бактериальных клеток. В то же время, если капля жидкости начнет подсыхать, то препарат будет слишком сильно загрязнен осадившимися компонентами раствора. Каплю раствора, содержащего бактериальные клетки (рассол), наносят на покровное стекло, выдерживают 5-60 минут (в зависимости от состава раствора). Затем, не дожидаясь высыхания капли, тщательно промывают дистиллированной водой (обмакивая препарат пинцетом в стакан несколько раз). После высушивания препарат готов для измерения на СЗМ.

Для примера приготовили препараты кисломолочных бактерий из рассола квашеной капусты. Время выдерживания капли рассола на покровном стекле выбрали 5 мин, 20 мин и 1 час (капля уже начала подсыхать). СЗМ - кадры представлены на Рис. 7 -12, Рис. 7 -13,
Рис. 7 -14.

Из рисунков видно, что для данного раствора оптимальное время инкубации 510 мин. Увеличение времени выдерживания капли на поверхности подложки приводит к слипанию бактериальных клеток. В случае же, когда капля раствора начинает подсыхать, наблюдается осаждение на стекло компонентов раствора, которые невозможно отмыть.

Рис. 7 12. Изображения кисломолочных бактерий на покровном стекле,
полученные с помощью СЗМ.

Рис. 7 13. Изображения кисломолочных бактерий на покровном стекле,
полученные с помощью СЗМ. Время инкубации раствора 20 мин

Рис. 7 14. Изображения кисломолочных бактерий на покровном стекле,
полученные с помощью СЗМ. Время инкубации раствора 1 час

На одном из отобранных препаратов (Рис. 7 -12) мы постарались рассмотреть, что же представляют собой кисломолочные бактерии, какая форма для них характерна в данном случае. (Рис. 7 -15)

Рис. 7 15. АСМ - изображение кисломолочных бактерий на покровном стекле.
Время инкубации раствора 5 мин

Рис. 7 16. АСМ - изображение цепочки кисломолочных бактерий на покровном стекле.
Время инкубации раствора 5 мин

Для рассола характерна форма бактерий палочковидной формы и расположение в виде цепочки.

Рис. 7 17. Окно управляющей программы учебного СЗМ NаnoEducator.
Панель инструментов

Используя инструменты программы учебного СЗМ NаnoEducator мы определили размеры бактериальных клеток. Они составили примерно от 0.5 × 1.6 мкм
до 0.8 × 3.5 мкм.

Полученные результаты сопоставляем с данными, приведенными в определителе бактерий Берджи [Лит. 7 -3].

Кисломолочные бактерии относятся к лактобактериям (Lactobacillus). Клетки имеют вид палочек, обычно правильной формы. Палочки длинные, иногда почти кокковидные, обычно в коротких цепочках. Размеры 0,5 - 1,2 Х 1,0 - 10 мкм. Спор не образуют; в редких случаях подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Широко распространены в окружающей среде, особенно часто встречаются в пищевых продуктах животного и растительного происхождения. Кисломолочные бактерии входят в нормальную микрофлору пищеварительного тракта. Всем известно, что квашеная капуста, помимо содержания в ней витаминов, полезна для улучшения микрофлоры кишечника.

Конструкция сканирующего зондового микроскопа NanoEducator

На Рис. 7 -18 представлен внешний вид измерительной головки СЗМ NanoEducator и обозначены основные элементы прибора, используемые при работе.

Рис. 7 18. Внешний вид измерительной головки СЗМ NanoEducator
1- основание, 2-держатель образца, 3- Датчик взаимодействия, 4-винт фиксации датчика,
5-винт ручного подвода, 6-винты перемещения сканера с образцом в горизонтальной плоскости, 7-защитная крышка с видеокамерой

На Рис. 7 -19 представлена конструкция измерительной головки. На основании 1 расположены сканер 8 с держателем образца 7 и механизм подвода образца к зонду 2 на основе шагового двигателя. В учебном СЗМ NanoEducator образец закрепляется на сканер, и осуществляется сканирование образцом относительно неподвижного зонда. Подвод зонда 6, закрепленного на датчике силового взаимодействия 4, к образцу можно также осуществлять с помощью винта ручного подвода 3. Предварительный выбор места исследования на образце осуществляется с помощью винта 9.

Рис. 7 19. Конструкция СЗМ NanoEducator: 1 – основание, 2 – механизм подвода,
3 – винт ручного подвода, 4 – датчик взаимодействия, 5 – винт фиксации датчика, 6 – зонд,
7 – держатель образца, 8 – сканер, 9, 10 – винты перемещения сканера с образцом

Учебный СЗМ NanoEducator состоит из соединенных кабелями измерительной головки, СЗМ контроллера и управляющего компьютера. Микроскоп оснащен видеокамерой. Сигнал от датчика взаимодействия после преобразования в предусилителе поступает в СЗМ контроллер. Управление работой СЗМ NanoEducator осуществляется от компьютера через СЗМ контроллер.

Датчик силового взаимодействия и зонд

В приборе NanoEducator датчик выполнен в виде пьезокерамической трубки длиной l =7 мм, диаметром d =1,2 мм и толщиной стенки h =0,25 мм, жестко закрепленной с одного конца. На внутреннюю поверхность трубки нанесен проводящий электрод. На внешнюю поверхность трубки нанесены два электрически изолированных полуцилиндрических электрода. К свободному концу трубки прикреплена вольфрамовая проволока диаметром
100 мкм (Рис. 7 -20).

Рис. 7 20. Конструкция универсального датчика прибора NanoEducator

Свободный конец проволоки, использующейся в качестве зонда, заточен электрохимически, радиус закругления имеет величину 0.2  0.05 мкм. Зонд имеет электрический контакт с внутренним электродом трубки, соединенным с заземленным корпусом прибора.

Наличие двух внешних электродов на пьезоэлектрической трубке позволяет в качестве датчика силового взаимодействия (датчика механических колебаний) использовать одну часть пьезоэлектрической трубки (верхнюю, в соответствии с Рис. 7 -21), а другую часть использовать в качестве пьезовибратора. К пьезовибратору подводится переменное электрическое напряжение с частотой, равной резонансной частоте силового датчика. Амплитуда колебаний при большом расстоянии зонд-образец максимальна. Как видно из Рис. 7 -22, в процессе колебаний зонд отклоняется от равновесного положения на величину А о, равную амплитуде его вынужденных механических колебаний (она составляет доли микрометра), при этом на второй части пьезотрубки (датчике колебаний) возникает переменное электрическое напряжение, пропорциональное смещению зонда, которое и измеряется прибором.

При приближении зонда к поверхности образца зонд начинает касаться образца в процессе колебаний. Это приводит к смещению амплитудно-частотной характеристики (АЧХ) колебаний датчика влево по сравнению с АЧХ, измеренной вдали от поверхности (Рис. 7 -22). Так как частота вынуждающих колебаний пьезотрубки поддерживается постоянной и равной частоте колебаний  о в свободном состоянии, то при приближении зонда к поверхности амплитуда его колебаний уменьшается и становится равной A. Эта амплитуда колебаний регистрируется со второй части пьезотрубки.

Рис. 7 21. Принцип работы пьезоэлектрической трубки
в качестве датчика силового взаимодействия

Рис. 7 22. Изменение частоты колебаний силового датчика
при приближении к поверхности образца

Сканер

Способ организации микроперемещений, использующийся в приборе NanoEducator , основан на использовании зажатой по периметру металлической мембраны, к поверхности которой приклеена пьезопластинка (Рис. 7 -23 а). Изменение размеров пьезопластинки под действием управляющего напряжения будет приводить к изгибу мембраны. Расположив такие мембраны по трем перпендикулярным сторонам куба и соединив их центры металлическими толкателями, можно получить 3 х -координатный сканер (Рис. 7 -23 б).

Рис. 7 23. Принцип действия (а) и конструкция (б) сканера прибора NanoEducator

Каждый пьезоэлемент 1, закрепленный на гранях куба 2, при приложении к нему электрического напряжения может передвигать прикрепленный к нему толкатель 3 в одном из трех взаимно перпендикулярных направлений – X, Y или Z. Как видно из рисунка, все три толкателя соединены в одной точке 4. С некоторым приближением можно считать, что эта точка перемещается по трем координатам X, Y, Z . К этой же точке прикрепляется стойка 5 с держателем образца 6. Таким образом, образец перемещается по трем координатам под действием трех независимых источников напряжения. В приборах NanoEducator максимальное перемещение образца составляет около 5070 мкм, что и определяет максимальную площадь сканирования.

Механизм автоматизированного подвода зонда к образцу (захват обратной связи)

Диапазон перемещений сканера по оси Z составляет около 10 мкм, поэтому перед началом сканирования необходимо приблизить зонд к образцу на это расстояние. Для этого предназначен механизм подвода, схема которого приведена на Рис. 7 -19. Шаговый двигатель 1 при подаче на него электрических импульсов вращает винт подачи 2 и перемещает планку 3 с зондом 4, приближая или отдаляя его от образца 5, установленного на сканере 6. Величина одного шага составляет около 2 мкм.

Рис. 7 24. Схема механизма подвода зонда к поверхности образца

Так как шаг механизма подвода значительно превосходит величину требуемого расстояния зонд-образец в процессе сканирования, то во избежание деформации зонда его подвод осуществляется при одновременной работе шагового двигателя и перемещениям сканера по оси Z по следующему алгоритму:

1. Система обратной связи отключается и сканер “втягивается”, т. е. опускает образец в нижнее крайнее положение.

2. Механизм подвода зонда производит один шаг и останавливается.

3. Система обратной связи включается, и сканер плавно поднимает образец, одновременно производится анализ наличия взаимодействия зонд-образец.

4. Если взаимодействие отсутствует, процесс повторяется с пункта 1.

Если во время вытягивания сканера вверх появится ненулевой сигнал, система обратной связи остановит движение сканера вверх и зафиксирует величину взаимодействия на заданном уровне. Величина силового взаимодействия, при котором произойдет остановка подвода зонда и будет происходить процесс сканирования, в приборе NanoEducator характеризуется параметром Подавление амплитуды (Amplitude Suppression ) :

A=A o . (1- Amplitude Suppression)

Получение СЗМ–изображения

После вызова программы NanoEducator на экране компьютера появляется главное окно программы (Рис. 7 -20). Работу следует начать с пункта меню Файл и в нем выбрать Открыть или Новый либо соответствующие им кнопки на панели инструментов (, ).

Выбор команды Файл  Новый означает переход к проведению СЗМ измерений, а выбор команды Файл  Открыть означает переход к просмотру и обработке ранее полученных данных. Программа позволяет осуществлять просмотр и обработку данных параллельно с измерениями.

Рис. 7 25. Главное окно программы NanoEducator

После выполнения команды Файл  Новый на экране появляется окно диалога, которое позволяет выбрать или создать рабочую папку, в который по умолчанию будут записываться результаты текущего измерения. В процессе проведения измерений все полученные данные последовательно записываются в файлы с именами ScanData+i.spm , где индекс i обнуляется при запуске программы и наращивается при каждом новом измерении. Файлы ScanData+i.spm помещаются в рабочую папку, который устанавливается перед началом измерений. Существует возможность выбора другой рабочей папки во время проведения измерений. Для этого необходимо нажать кнопку , расположенную на панели инструментов главного окна программы и выбрать пункт меню Изменить рабочую папку .

Для сохранения результатов текущего измерения необходимо нажать кнопку Сохранить как в Окне сканирования в появившемся окне диалога выбрать папку и указать имя файла, при этом файл ScanData+i.spm , который служит временным файлом сохранения данных в процессе проведения измерений, будет переименован в заданное вами имя файла. По умолчанию файл будет сохранен в рабочей папке, назначенном перед началом измерений. Если не выполнить операцию сохранения результатов измерений, то при следующем запуске программы результаты, записанные во временных файлах ScanData+i.spm , будут последовательно перезаписываться (если не изменена рабочая папка). О наличии временных файлов результатов измерений в рабочей папке выдается предупреждение перед закрытием и после запуска программы. Смена рабочей папки перед началом проведения измерений позволяет защитить результаты предыдущего эксперимента от удаления. Стандартное имя ScanData можно изменить, задав его в окне выбора рабочей папке. Вызов окна выбора рабочей папки происходит при нажатии кнопки , расположенной на панели инструментов главного окна программы. Сохранить результаты измерений можно также в окне Браузер сканов , поочередновыделяя необходимые файлы и сохраняя их в выбранной папке.

Существует возможность экспорта результатов, полученных при помощи прибора NanoEducator в ASCII формат и формат Nova (фирма НТМДТ), который может быть импортирован программой НТ МДТ Nova, Image Analysis и другими программами. В ASCII формат экспортируются изображения сканов, данные их сечений, результаты измерения спектроскопии. Для экспорта данных необходимо нажать кнопку Экспорт , расположенную в инструментальной панели главного окна программы, либо выбрать Экспорт в пункте меню Файл этого окна и выбрать соответствующий формат экспорта. Данные для обработки и анализа можно сразу послать в предварительно запущенную программу Image Analysis.

После закрытия окна диалога на экран выводится панель управления прибором
(Рис. 7 -26).

Рис. 7 26. Панель управления прибором

В левой части панели управления прибором расположены кнопки выбора конфигурации СЗМ:

ССМ – сканирующий силовой микроскоп (ССМ)

СТМ – сканирующий туннельный микроскоп (СТМ).

Проведение измерений на учебном СЗМ NanoEducator заключается в выполнении следующих операций:

1. Установка образца

ВНИМАНИЕ! Перед установкой образца необходимо снять датчик с зондом, чтобы не повредить зонд.

Предусмотрено два способа крепления образца:

на магнитном столике (в этом случае образец должен быть прикреплен к магнитной подложке);

на двусторонней липкой ленте.

ВНИМАНИЕ! Для установки образца на двусторонней липкой ленте, необходимо вывинтить держатель из стойки (чтобы не повредить сканер), а затем вновь ввинтить его до легкого упора.

В случае магнитного крепления замена образца может производиться без отвинчивания держателя образца.

2. Установка зондового датчика

ВНИМАНИЕ! Устанавливать датчик с зондом следует всегда после установки образца.

Выбрав нужный зондовый датчик (держите датчик за металлические кромки основания) (см. Рис. 7 -27), ослабьте винт фиксации зондового датчика 2 на крышке измерительной головки, вставьте датчик в гнездо держателя до упора, завинтите винт фиксации по часовой стрелке до легкого упора.

Рис. 7 27. Установка зондового датчика

3. Выбор места сканирования

При выборе на образце участка для исследования используйте винты перемещения двухкоординатного столика, расположенного в нижней части прибора.

4. Предварительный подвод зонда к образцу

Операция предварительного подвода не является обязательной для каждого измерения, необходимость ее выполнения зависит от величины расстояния между образцом и острием зонда. Операцию предварительного сближения желательно производить, если расстояние между кончиком зонда и поверхностью образца превышает 0.51 мм. При использовании автоматизированного подвода зонда к образцу с большого расстояния между ними процесс подвода займет очень много времени.

Воспользуйтесь винтом ручного подвода для опускания зонда, контролируя расстояние между ним и поверхностью образца визуально.

5. Построение резонансной кривой и установка рабочей частоты

Эта операция обязательно выполняется в начале каждого измерения и, пока она не произведена, переход к дальнейшим этапам измерений заблокирован. Кроме того, в процессе измерений иногда возникают ситуации, требующие повторного выполнения этой операции (например, при потере контакта).

Окно поиска резонанса вызывается нажатием кнопки панели управления прибором. Выполнение этой операции предусматривает измерение амплитуды колебаний зонда при изменении частоты вынужденных колебаний, задаваемых генератором. Для этого необходимо нажать кнопку RUN (Рис. 7 -28).

Рис. 7 28. Окно операции поиска резонанса и установки рабочей частоты:
а) – автоматический режим, б) – ручной режим

В режиме Авто автоматически устанавливается частота генератора, равная частоте, при которой наблюдалась максимальная амплитуда колебаний зонда. График, демонстрирующий изменение амплитуды колебаний зонда в заданном диапазоне частот (Рис. 7 -28а), позволяет наблюдать форму резонансного пика. Если резонансный пик недостаточно ярко выражен, или амплитуда при частоте резонанса мала (менее 1В ), то необходимо изменить параметры проведения измерений и повторно провести определение резонансной частоты.

Для этого предназначен режим Ручной . При выборе этого режима в окне Определение резонансной частоты появляется дополнительная панель
(Рис. 7 -28б), позволяющая корректировать следующие параметры:

Напряжение раскачки зонда , задаваемых генератором. Рекомендуется устанавливать эту величину минимальной (вплоть до нуля) и не более 50 мВ.

Коэффициент усиления амплитуды (Усиление амплитуды ). При недостаточной величине амплитуды колебаний зонда (<1 В) рекомендуется увеличить коэффициент Усиление амплитуды .

Для начала операции поиска резонанса необходимо нажать кнопку Старт .

Режим Ручной позволяет вручную менять выбранную частоту, передвигая зеленый курсор на графике с помощью мыши, а также уточнить характер изменения амплитуды колебаний в узком диапазоне значений вокруг выбранной частоты (для этого необходимо установить переключатель Ручной режим в положение Точно и нажать кнопку Старт ).

6. Захват взаимодействия

Для захвата взаимодействия выполняется процедура контролируемого сближения зонда и образца с помощью механизма автоматизированного подвода. Окно управления этой процедурой вызывается нажатием кнопки панели управления прибором. При работе с ССМ эта кнопка становится доступной после выполнения операции поиска и установки резонансной частоты. Окно ССМ, Подвод (Рис. 7 -29) содержит элементы управления подводом зонда, а также индикации параметров, которые позволяют анализировать ход выполнения процедуры.

Рис. 7 29. Окно процедуры подвода зонда

В окне Подвод пользователь имеет возможность наблюдать за следующими величинами:

удлинением сканера (Сканер Z ) по оси Z относительно максимально возможной, принятой за единицу. Величина относительного удлинения сканера характеризуется уровнем заполнения левого индикатора цветом, соответствующим зоне, в которой находится сканер в текущий момент: зеленый цвет – рабочая зона, синий – вне рабочей зоны, красный – сканер подошел слишком близко к поверхности образца, что может повлечь деформацию зонда. В последнем случае программа выдает звуковое предупреждение;

амплитудой колебаний зонда относительно амплитуды его колебаний в отсутствии силового взаимодействия, принятой за единицу. Величина относительной амплитуды колебаний зонда показана на правом индикаторе уровнем его заполнения бордовым цветом. Горизонтальная метка на индикаторе Амплитудой колебаний зонда указывает на уровень, при переходе через который производится анализ состояния сканера и его автоматический вывод в рабочее положение;

количество шагов (Ш аги ), пройденных в заданном направлении: Подвод – сближение, Отвод – удаление.

До начала процесса опускания зонда необходимо:

Проверить правильность установок параметров сближения:

Коэффициент усиления в цепи обратной связи Усиление ОС установлен на значении 3 ,

Убедиться, что параметр Подавление амплитуды (Сила) имеет величину около 0,2 (см. Рис. 7 -29). В противном случае нажать кнопку Сила и в окне Установка параметров взаимодействия(Рис. 7 -30) установитьзначениеПодавление амплитуды равное 0.2. Для более деликатного подводазначение параметраПодавление амплитуды может быть меньше.

Проверить правильность установок в окне параметров Параметры , страница Параметры подвода .

Имеется взаимодействие или нет, можно определить по левому индикатору Сканер Z . Полное удлинение сканера (весь индикатор Сканер Z окрашен синим цветом), а также полностью закрашенный бордовым цветом индикатор Амплитуда колебаний зонда (Рис. 7 -29) указывают на отсутствие взаимодействия. После выполнения поиска резонанса и установки рабочей частоты амплитуда свободных колебаний зонда принимается за единицу.

Если же сканер удлинен не полностью до или во время сближения, либо программа выдает сообщение: ‘Ошибка! Зонд слишком близок к образцу. Проверьте параметры подвода или физический узел. Вы хотите отойти в безопасное место" , то рекомендуется приостановить выполнение процедуры подвода и:

a. изменить один из параметров:

увеличить величину взаимодействия, параметр Подавление амплитуды , либо

увеличить значение Усиление ОС , либо

увеличить время задержки между шагами сближения (параметр Время интегрирования на странице Параметры подвода окна Параметры ).

b. увеличить расстояние между острием зонда и образцом (для этого выполнить действия, описанные в пункте и выполнить операцию Резонанс , после чего вернуться к выполнению процедуры Подвод .

Рис. 7 30. Окно установки величины взаимодействия зонда и образца

После захвата взаимодействия появляется сообщение “Подвод выполнен” .

При необходимости осуществить сближение на один шаг, следует нажать кнопку . В этом случае сначала выполняется шаг, а потом осуществляется проверка критериев захвата взаимодействия. Для остановки движения необходимо нажать кнопку . Для выполнения операции отвода необходимо нажать кнопку для быстрого отвода

или нажать кнопку для медленного отвода. При необходимости осуществить отвод на один шаг, следует нажать кнопку . В этом случае сначала выполняется шаг, а потом осуществляется проверка критериев захвата взаимодействия

7. Сканирование

После выполнения процедуры подвода (Подвод ) и захвата взаимодействия становится доступным сканирование (кнопка в окне панели управления прибором).

Нажав эту кнопку (вид окна сканирования представлен на Рис. 7 -31), пользователь приступает непосредственно к проведению измерений и получению результатов измерений.

Перед проведением процесса сканирования необходимо установить параметры сканирования. Эти параметры сгруппированы в правой части верхней панели окна Сканирование .

В первый раз после запуска программы они устанавливаются по умолчанию:

Площадь сканирования - Область (X нм* Y нм) : 5000*5000 нм;

Количество точек измерений по осям - X, Y: NX =100, NY =100;

Путь сканирования - Направление определяет направление сканирования. Программа позволяет выбирать направление оси быстрого сканирования (Х или Y). При запуске программы устанавливается Направление

После задания параметров сканирования необходимо нажать кнопку Применить для подтверждения ввода параметров и кнопку Старт для начала сканирования.

Рис. 7 31. Окно управления процессом и отображения результатов сканирования ССМ

7.4.Методические указания

Прежде чем приступить к работе на сканирующем зондовом микроскопе NanoEducator следует изучить руководство пользователя прибора [Лит. 7 -4].

7.5.Техника безопасности

Для питания прибора используется напряжение 220 В. Эксплуатацию сканирующего зондового микроскопа NanoEducator производить в соответствии с ПТЭ и ПТБ электроустановок потребителей напряжением до 1000 В.

7.6.Задание

1. Подготовьте самостоятельно биологические образцы для исследований методом СЗМ.

2. Изучите на практике общую конструкцию прибора NanoEducator.

3. Познакомьтесь с программой управления прибором NanoEducator.

4. Получите первое СЗМ изображение под контролем преподавателя.

5. Проведите обработку и анализ полученного изображения. Какие формы бактерий характерны для вашего раствора? Чем определяется форма и размеры бактериальных клеток?

6. Возьмите Определитель бактерий Берджи и сравните полученные результаты с описанными там.

7.7.Контрольные вопросы

1. Какие существуют методы исследования биологических объектов?

2. Что такое сканирующая зондовая микроскопия? Какой принцип лежит в ее основе?

3. Назовите основные компоненты СЗМ и их назначение.

4. Что такое пьезоэлектрический эффект и как он применяется в СЗМ. Опишите различные конструкции сканеров.

5. Опишите общую конструкцию прибора NanoEducator.

6. Опишите датчик силового взаимодействия и принцип его действия.

7. Опишите механизм подвода зонда к образцу в приборе NanoEducator. Поясните параметры, определяющие силу взаимодействия зонда с образцом.

8. Объясните принцип сканирования и работы системы обратной связи. Расскажите о критериях выбора параметров сканирования.

7.8.Литература

Лит. 7 1. Поль де Крюи. Охотники за микробами. М. Терра. 2001.

Лит. 7 2. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред Егорова Н.С. М.: Наука, 1995.

Лит. 7 3. Хоулт Дж., Криг Н., П. Снит, Дж. Стейли, С. Уильямс. // Определитель бактерий Берджи. М.:Мир, 1997. Т.№ 2. C. 574.

Лит. 7 4. Руководство пользователя прибора NanoEducator .объектов . Нижний Новгород. Научно-образовательный центр...

Первыми устройствами, с помощью которых стало возможным наблюдать за нанообъектами и передвигать их, стали сканирующие зондовые микроскопы - атомно-силовой микроскоп и работающий по аналогичному принципу сканирующий туннельный микроскоп. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) была разработана Г. Биннигом и Г. Рорером, которым за эти исследования в 1986 была присуждена Нобелевская премия. Создание атомно-силового микроскопа, способного чувствовать силы притяжения и отталкивания, возникающие между отдельными атомами, дало возможность, наконец, «пощупать и увидеть» нанообъекты.

Рисунок 9. Принцип работы сканирующего зондового микроскопа (взято из http://www.nanometer.ru/2007/06/06/atomno_silovaa_mikroskopia_2609.html#). Пунктиром показан ход луча лазера. Остальные объяснения в тексте.

Основой АСМ (см. рис. 9) служит зонд, обычно сделанный из кремния и представляющий собой тонкую пластинку-консоль (ее называют кантилевером, от английского слова "cantilever" - консоль, балка). На конце кантилевера (длина » 500 мкм, ширина » 50 мкм, толщина » 1 мкм) расположен очень острый шип (длина » 10 мкм, радиус закругления от 1 до 10 нм), оканчивающийся группой из одного или нескольких атомов (см. рис.10).

Рисунок 10. Электронные микрофото одного и того же зонда, сделанные с малым (верх) и большим увеличением.

При перемещении микрозонда вдоль поверхности образца острие шипа приподнимается и опускается, очерчивая микрорельеф поверхности, подобно тому, как скользит по грампластинке патефонная игла. На выступающем конце кантилевера (над шипом, см. рис. 9) расположена зеркальная площадка, на которую падает и от которой отражается луч лазера. Когда шип опускается и поднимается на неровностях поверхности, отраженный луч отклоняется, и это отклонение регистрируется фотодетектором, а сила, с которой шип притягивается к близлежащим атомам – пьезодатчиком.

Данные фотодетектора и пьезодатчика используются в системе обратной связи, которая может обеспечивать, например, постоянную величину силу взаимодействия между микрозондом и поверхностью образца. В результате, можно строить объёмный рельеф поверхности образца в режиме реального времени. Разрешающая способность АСМ метода составляет примерно 0,1-1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали. Изображение бактерии кишечной палочки, полученное с помощью сканирующего зондового микроскопа, показано на рис. 11.

Рисунок 11. Бактерия кишечной палочки (Escherichia coli ). Изображение получено с помощью сканирующего зондового микроскопа. Длина бактерии – 1,9 мкм, ширина – 1 мкм. Толщина жгутиков и ресничек – 30 нм и 20 нм, соответственно.

Другая группа сканирующих зондовых микроскопов для построения рельефа поверхности использует так называемый квантово-механический «туннельный эффект». Суть туннельного эффекта состоит в том, что электрический ток между острой металлической иглой и поверхностью, расположенной на расстоянии около 1 нм, начинает зависеть от этого расстояния – чем меньше расстояние, тем больше ток. Если между иглой и поверхностью прикладывать напряжение 10 В, то этот «туннельный» ток может составить от 10 рА до 10 нА. Измеряя этот ток и поддерживая его постоянным, можно сохранять постоянным и расстояние между иглой и поверхностью. Это позволяет строить объёмный профиль поверхности (см. рис. 12). В отличие от атомно-силового микроскопа, сканирующий туннельный микроскоп может изучать только поверхности металлов или полупроводников.

Рисунок 12. Игла сканирующего туннельного микроскопа, находящаяся на постоянном расстоянии (см. стрелки) над слоями атомов исследуемой поверхности.

Сканирующий туннельный микроскоп можно использовать и для перемещения какого-либо атома в точку, выбранную оператором. Например, если напряжение между иглой микроскопа и поверхностью образца сделать в несколько больше, чем надо для изучения этой поверхности, то ближайший к ней атом образца превращается в ион и "перескакивает" на иглу. После этого слегка переместив иглу и изменив напряжение, можно заставить сбежавший атом "спрыгнуть" обратно на поверхность образца. Таким образом, можно манипулировать атомами и создавать наноструктуры, т.е. структуры на поверхности, имеющие размеры порядка нанометра. Ещё в 1990 году сотрудники IBM показали, что это возможно, сложив из 35 атомов ксенона название своей компании на пластинке из никеля (см. рис. 13).

Рисунок 13. Сложенное из 35 атомов ксенона на пластинке из никеля название компании IBM, сделанное сотрудниками этой компании с помощью сканирующей зондового микроскопа в 1990 году.

С помощью зондового микроскопа можно не только двигать атомы, но и создавать предпосылки для их самоорганизации. Например, если на металлической пластине находится капля воды, содержащая ионы тиолов, то зонд микроскопа будет способствовать такой ориентации этих молекул, при которой их два углеводородных хвоста будут обращены от пластины. В результате, можно выстроить монослой тиольных молекул, прилипших к металлической пластине (см. рис. 14). Этот способ создания монослоя молекул на поверхности металла называют «перьевой нанолитографией».

Рисунок 14. Слева вверху – кантилевер (серо-стальной) сканирующего зондового микроскопа над металлической пластинкой. Справа – увеличенное изображение области (обведена белым на рисунке слева) под зондом кантилевера, на которой схематически показаны молекулы тиола с фиолетовыми углеводородными хвостами, выстраивающимися в монослой у кончика зонда. Взято из Scientific American, 2001, Sept, p. 44.

Впервые идея получения изображения сверхвысокого разрешение поверхности образца с помощью острого зонда была высказана в 1966 и реализована в 1972 году Расселом Янгом, который занимался физикой поверхности. Схема установки Янга приведена на рисунке. Исследуемый проводящий образец закрепляется на механизме грубого подвода, основанном на дифференциальном микровинте. Образец подводится к острой вольфрамовой игле, закреплённой на прецизионном XYZ-сканере с пьезоприводом. Разность потенциалов, приложенная между иглой-зондом и образцом вызывает эмиссию электронов, которая регистрируется прибором. Механизм обратной связи поддерживает постоянный эмиссионный ток, изменяя положение зонда по Z-координате (т.е. расстояние между зондом и поверхностью). Запись сигнала обратной связи на самописце или осциллографе позволяет восстановить рельеф поверхности.

Хотя пространственное разрешение прибора Янга в плоскости образца не превосходило разрешение обычного оптического микроскопа, установка обладала всеми характерными признаками СЗМ и позволяла различить атомарные слои на образце.

Через несколько лет, в конце 70-х, физики Герд Бинниг и Генрих Рорер из исследовательской лаборатории IBM в Цюрихе, начали разработку установки, которая в последствии стала первым сканирующим туннельным микроскопом. Имея большой опыт в электронной микроскопии, и исследуя туннельный эффект, они пришли к идее созданий установки, схожей с Topografiner"ом Янга.

Но вместо эмиссионного тока они использовали ток туннельного эффекта, что позволило увеличить разрешение прибора на порядки. Было получено множество изображений с атомарным разрешением, дальнейшее совершенствование прибора привело к созданию множества других типов СЗМ. В 1986 за создание сканирующего туннельного микроскопа Бинниг и Рорер получили Нобелевскую премию по физике. Историю создания первого СТМ можно узнать из нобелевской речи Биннига
С дальнейшим совершенствованием установок исследователи научились не только измерять топографию поверхности, но и манипулировать отдельными атомами! Важность этого события сравнима с выводом первого искусственного спутника на орбиту Земли, и, возможно, это первый шаг к созданию важнейших технологий будущего.

Использование туннельного эффекта в СТМ позволяет не только получить сверхвысокое разрешение, но и накладывает ряд существенных ограничений на исследуемый образец: он должен быть проводящим, и измерения желательно проводить в глубоком вакууме. Это сильно сужает область применимости СТМ. Поэтому исследователи сосредоточили свои усилия на создании новых типов СЗМ, лишённых данных ограничений. В 1986 году выходит статья Биннига, Квата и Гербера, в которой описывается новый тип микроскопа -- Атомно-Силовой Микроскоп (АСМ, Atomic Force Microscope -- AFM). В данном типе микроскопа используется особый зонд -- кантилевер -- острая кремниевая игла, закреплённая на конце пружинящей балки. При сближении этой иглы и поверхности образца до расстояния порядка десятка нанометров (если поверхность образца предварительно очищено от слоя воды), балка начинает отклоняться в сторону образца, т.к. остриё иглы вступает в взаимодействие с поверхностью посредством сил Ван-дер-Ваальса. При дальнейшем приближении к поверхности игла отклоняется в противоположную сторону в результате действия электростатических сил отталкивания. Отклонение иглы от положения равновесия в установке Биннига детектировалось с помощью иглы туннельного микроскопа.

Использование кантилевера позволило исследовать непроводящие образцы. А дальнейшее совершенствование систем детектирования привело к созданию микроскопов, которые могут производить измерения не только на воздухе, но в жидкости, что особенно важно при исследовании биологических образцов. Кроме того, развиты методы измерения силового взаимодействия кантилевера и образца, с помощью которых стало возможно определить силы взаимодействия между отдельными атомами с характерными величинами на уровне 10 -9 ньютона.

С середины 80-х годов наблюдается взрывной рост количества публикаций, связанный с зондовой микроскопией. Появилось множество разновидностей СЗМ, появилось множество коммерчески доступных приборов, вышли учебники по зондовой микроскопии, основы работы СЗМ изучаются в курсах многих высших учебных заведений.

Сканирующий зондовый микроскоп

Наиболее молодое и вместе с тем перспективное направление в исследовании свойств поверхности – сканирующая зондовая микроскопия. Зондовые микроскопы имеют рекордное разрешение – менее 0,1 нм. Они могут измерить взаимодействие между поверхностью и сканирующим ее микроскопическим острием – зондом – и выводят трехмерное изображение на экран компьютера.

Методы зондовой микроскопии позволяют не только видеть атомы и молекулы, но и воздействовать на них. При этом – что особенно важно – объекты могут изучаться не обязательно в вакууме (что обычно для электронных микроскопов), но и в различных газах и жидкостях.

Изобрели зондовый – сканирующий туннельный микроскоп в 1981 году сотрудники Исследовательского центра фирмы ИБМ Г. Биннинг и Х. Рорер (США). Через пять лет за это изобретение они были удостоены Нобелевской премии.

Биннинг и Рорер попытались сконструировать прибор для исследования участков поверхности размером менее 10 нм. Итог превзошел самые смелые ожидания: ученым удалось увидеть отдельные атомы, размер которых в поперечнике составляет лишь около одного нанометра. В основе работы сканирующего туннельного микроскопа лежит квантово-механическое явление, называемое туннельным эффектом. Очень тонкое металлическое острие – отрицательно заряженный зонд – подводится на близкое расстояние к образцу, тоже металлическому, заряженному положительно. В тот момент, когда расстояние между ними достигнет нескольких межатомных расстояний, электроны начнут свободно проходить через него – «туннелировать»: через зазор потечет ток.

Очень важное значение для работы микроскопа имеет резкая зависимость силы туннельного тока от расстояния между острием и поверхностью образца. При уменьшении зазора всего на 0,1 нм ток возрастет примерно в 10 раз. Поэтому даже неровности размером с атом вызывают заметные колебания величины тока.

Чтобы получить изображение, зонд сканирует поверхность, а электронная система считывает величину тока. В зависимости от того, как эта величина меняется, острие либо опускается или поднимается. Таким образом, система поддерживает величину тока постоянной, а траектория движения острия повторяет рельеф поверхности, огибая возвышенности и углубления.

Острие перемещает пьезосканер, который представляет собой манипулятор из материала, способного изменяться под действием электрического напряжения. Пьезосканер чаще всего имеет форму трубки с несколькими электродами, которая удлиняется или изгибается, перемещая зонд по разным направлениям с точностью до тысячных долей нанометра.

Информация о движении острия преобразуется в изображение поверхности, которое строится по точкам на экране. Участки разной высоты для наглядности окрашиваются в различные цвета.

В идеале на конце острия зонда должен находиться один неподвижный атом. Если же на конце иглы случайно оказалось несколько выступов, изображение может двоиться, троиться. Для устранения дефекта иглу травят в кислоте, придавая ей нужную форму.

С помощью туннельного микроскопа удалось сделать ряд открытий. Например, обнаружили, что атомы на поверхности кристалла расположены не так, как внутри, и часто образуют сложные структуры.

С помощью туннельного микроскопа можно изучать лишь проводящие ток объекты. Однако он позволяет наблюдать и тонкие диэлектрики в виде пленки, когда их помещают на поверхность проводящего материала. И хотя этот эффект еще не нашел полного объяснения, тем не менее его с успехом применяют для изучения многих органических пленок и биологических объектов – белков, вирусов.

Возможности микроскопа велики. С помощью иглы микроскопа даже наносят рисунки на металлические пластины. Для этого используют в качестве «пишущего» материала отдельные атомы – их осаждают на поверхность или удаляют с нее. Таким образом в 1991 году сотрудники фирмы ИБМ написали атомами ксенона на поверхности никелевой пластины название своей фирмы – IBM. Букву «I» составили всего 9 атомов, а буквы «B» и «M» – 13 атомов каждую.

Следующим шаг в развитии сканирующей зондовой микроскопии сделали в 1986 году Биннинг, Квейт и Гербер. Они создали атомно-силовой микроскоп. Если в туннельном микроскопе решающую роль играет резкая зависимость туннельного тока от расстояния между зондом и образцом, то для атомно-силового микроскопа решающее значение имеет зависимость силы взаимодействия тел от расстояния между ними.

Зондом атомно-силового микроскопа служит миниатюрная упругая пластина – кантилевер. Причем один ее конец закреплен, на другом же конце сформировано зондирующее острие из твердого материала – кремния или нитрида кремния. При перемещении зонда силы взаимодействия между его атомами и неровной поверхностью образца будут изгибать пластину. Добившись такого перемещения зонда, когда прогиб остается постоянным, можно получить изображение профиля поверхности. Такой режим работы микроскопа, называющийся контактным, позволяет измерять с разрешением в доли нанометра не только рельеф, но и силу трения, упругость и вязкость исследуемого объекта.

Сканирование в контакте с образцом довольно часто приводит к его деформации и разрушению. Воздействие зонда на поверхность может быть полезным, например, при изготовлении микросхем. Однако зонд способен легко порвать тонкую полимерную пленку или повредить бактерию, вызвав ее гибель. Чтобы избежать этого, кантилевер приводят в резонансные колебания вблизи поверхности и регистрируют изменение амплитуды, частоты или фазы колебаний, вызванных взаимодействием с поверхностью. Такой метод позволяет изучать живые микробы: колеблющаяся игла действует на бактерию, как легкий массаж, не причиняя вреда и позволяя наблюдать за ее движением, ростом и делением.

В 1987 году И. Мартин и К. Викрама-сингх (США) предложили в качестве зондирующего острия использовать намагниченную микроиглу. В результате появился магнитно-силовой микроскоп.

Такой микроскоп позволяет разглядеть отдельные магнитные области в материале – домены – размером до 10 нм. Его также применяют и для сверхплотной записи информации, формируя на поверхности пленки домены с помощью полей иглы и постоянного магнита. Подобная запись в сотни раз плотнее, чем на современных магнитных и оптических дисках.

На мировом рынке микромеханики, где заправляют такие гиганты, как ИБМ, «Хитачи», «Жиллетт», «Поляроид», «Олимпус», «Джойл», «Диджитал инструментс», нашлось место и для России. Все громче слышен голос маленькой фирмы МДТ из подмосковного Зеленограда.

«Давайте скопируем на пластину, в 10 раз меньшую человеческого волоса, наскальный рисунок, выполненный нашими далекими предками, – предлагает главный технолог Денис Шабратов. – Компьютер управляет "кистью", зондом – иглой длиной 15 микрон, диаметром в сотые доли микрона. Игла движется вдоль "полотна", и там, где его касается, появляется мазок размером с атом. Постепенно на экране дисплея возникает олень, за которым гонятся всадники».

МДТ единственная в стране фирма-изготовитель зондовых микроскопов и самих зондов. Она входит в четверку мировых лидеров. Изделия фирмы покупают в США, Японии, Европе.

А все началось с того, что Денис Шабратов и Аркадий Гологанов, молодые инженеры одного из оказавшихся в кризисе институтов Зеленограда, думая, как жить дальше, выбрали микромеханику. Они не без основания посчитали ее наиболее перспективным направлением.

«Мы не комплексовали, что придется соперничать с сильными конкурентами, – вспоминает Гологанов. – Конечно, наше оборудование уступает импортному, но, с другой стороны, это заставляет исхитряться, шевелить мозгами. А уж они-то у нас точно не хуже. И готовности пахать хоть отбавляй. Работали сутками, без выходных. Самым трудным оказалось даже не изготовить суперминиатюрный зонд, а продать. Знаем, что наш лучший в мире, кричим о нем по Интернету, засыпаем клиентов факсами, словом, бьем ножками, как та лягушка, – ноль внимания».

Узнав, что один из лидеров по производству микроскопов – японская фирм «Джойл» ищет иглы очень сложной формы, они поняли, что это их шанс. Заказ стоил много сил и нервов, а получили гроши. Но деньги не были главным – теперь они могли во весь голос объявить: знаменитый «Джойл» – наш заказчик. Подобным образом почти полтора года МДТ бесплатно изготавливала специальные зонды для Национального института стандартов и технологий США. И новое громкое имя появилось в списке клиентов.

«Сейчас поток заказов таков, что мы уже не можем удовлетворить всех желающих, – говорит Шабратов. – Увы, это специфика России. Опыт показал, у нас имеет смысл выпускать столь наукоемкую продукцию малыми сериями, массовое же производство – налаживать за рубежом, где нет срывов поставок, низкого их качества, необязательности смежников».

Возникновение сканирующей зондовой микроскопии удачно совпало с началом бурного развития компьютерной техники, открывающей новые возможности использования зондовых микроскопов. В 1998 году в Центре перспективных технологий (Москва) создана модель сканирующего зондового микроскопа «ФемтоСкан-001», которым управляют также через Интернет. Теперь в любой точке земного шара исследователь сможет работать на микроскопе, а каждый желающий – «заглянуть» в микромир, не отходя от компьютера.

Сегодня подобные микроскопы используются только в научных исследованиях. С их помощью совершаются наиболее сенсационные открытия в генетике и медицине, создаются материалы с удивительными свойствами. Однако уже в ближайшее время ожидается прорыв, и прежде всего, в медицине и микроэлектронике. Появятся микророботы, доставляющие по сосудам лекарства непосредственно к больным органам, будут созданы миниатюрные суперкомпьютеры.